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• 发布时间：2021-06-15
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【概要描述】　　利用溶解度的差异

　　不同的蛋白质具有不同的溶解度，蛋白质分子在水中的溶解度主要取决于蛋白质分子表面的水化层厚度和带电荷数量。 [15] 不同的蛋白质分子，由于其分子表面极性基团的种类、数量以及排布不同，其水化层的厚度和带电荷数量也不同，从而造成蛋白质的溶解度不同。此外，外界环境因素如溶液的pH值、离子强度、温度以及介电常数等都可以影响蛋白质的溶解度。因此，适当改变外界因素可以降低蛋白质混合溶液中蛋白质的溶解度，提高分 离效果。

　　盐析法

　　盐析法是向蛋白质溶液中加入高浓度中性盐，盐离子与水分子的相互作用可以使水分子的活度和蛋白质的水合程度降低，最终导致蛋白质的溶解度降低，形成沉淀析出的过程。常用的盐析剂是硫酸铵，因为其盐析能力强，浓度高时也不会使蛋白质的生物活性丧失。盐析法的优点是操作简便，能除去较多的杂质蛋白，可以保护易变性的蛋白质，有一定的浓缩作用;缺点是分辨能力差，纯化倍数不高，需要透析除盐。陈秀清 [16] 等比较了利用酸加 热法、碱加热法、盐析法和有机溶剂法提取南美蟛蜞菊叶蛋白的效果，结果发现，盐析法是提取南美蟛蜞菊叶蛋白的最适方法，蛋白质提取率高，且活性较好。

　　等电点沉淀法

　　等电点沉淀法的原理：蛋白质是两性电解质，其溶解度与净电荷数量相关，当溶液的pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最低，形成沉淀。不同的蛋白质有不同的等电点，利用蛋白质等电点的差异，调节溶液的pH值等于目的蛋白的等电点，使目的蛋白沉淀，通过离心可以得到所需要的目的蛋白。朱秀灵 [17] 等利用等电点沉淀法制备芝麻蛋白，并与超滤法制备的芝麻蛋白进行比较，结果表明，等电点沉淀法制备的芝麻蛋白的泡沫稳定性优于超滤法制备的芝麻蛋白。

　　有机溶剂沉淀法

　　有机溶剂沉淀法的原理：一方面，极性有机溶剂可以降低水的介电常数，使蛋白质分子的水化程度降低，促进蛋白质分子的聚集沉淀;另一方面，极性有机溶剂能够破坏蛋白质分子表面的水化层，使蛋白质分子发生沉淀。乙醇、丙酮是两种最常用的有机溶剂，且须在低温下使用。

　　利用大小差异

　　蛋白质是大分子物质，可以考虑用透析法、超滤法等将小分子物质除去，还可以用凝胶过滤层析法根据蛋白质分子量将目的蛋白与杂质蛋白分离。

　　透析法

　　透析法是利用半透膜的截留作用，蛋白质大分子不能通过半透膜而小分子杂质可以通过半透膜，从而使蛋白质与小分子杂质分开的方法。将蛋白质溶液装在具有一定截留分子量半透膜的透析袋中，置于蒸馏水中透析，为了缩短透析时间，可以经常换水，一定时间后小分子杂质通过半透膜而除去，目的蛋白仍留在透析袋中保存下来。

　　超滤法

　　超滤法主要是根据超滤膜的孔径大小分离纯化目的蛋白，即比超滤膜孔径大的蛋白质分子被截留而保存下来，比超滤膜孔径小的杂质分子则不被截留而除去。杨国龙 [18] 等利用超滤法生产大豆浓缩蛋白，主要是通过平板聚醚砜超滤膜除去大豆浓缩蛋白生产过程中的可溶性多糖等小分子杂质，从而得到蛋白质含量大于72%的大豆浓缩蛋白。

　　凝胶过滤层析法

　　凝胶过滤层析也称分子筛层析、分子排阻层析，是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。当大小不同的蛋白质分子混合物流经凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的蛋白质分子不能进入网孔，而是随着缓冲液在网孔外侧向下移动，并最先流到柱外;比凝胶网孔小的蛋白质分子可以顺利进入网孔，并根据蛋白质分子量进出不同孔径的网 孔，然后随着缓冲液流到柱外。较大分子量的蛋白质分子移动的路程短，最先流出，较小分子量的蛋 白质分子移动的路程长，最后流出，从而使不同分子量的蛋白质得以分离纯化。邹存媛等利用中性蛋白酶酶解大豆蛋白，通过正交试验确定大豆蛋白肽的最优提取条件，并采用凝胶过滤色谱法分离收集分子量小于1200Da的小肽。

　　利用电荷差异

　　蛋白质分子含有羧基、氨基等可解离的基团， 由于不同蛋白质分子的结构不同，其电离基团的组成及在分子表面的暴露情况不同，因此不同蛋白质分子所带电荷的性质及净电荷量也不同。根据蛋白质分子的电荷差异，可采用电泳法和离子交换层析法进行分离纯化。

　　电泳法

　　在一定 pH值的溶液中，蛋白质分子可以解离成带正电荷和负电荷的分子，在直流电场中，带正电荷的分子向负极移动，带负电荷的分子向正极移动。不同的蛋白质分子由于净电荷量和分子量大小不同，在相同条件下电泳时，电泳速度各不相同，从而彼此分开。常见的电泳有聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向电泳、等电聚焦电泳等。Magdalena Montowska 等为了寻找六种肉类蛋白质的区别以及获得具有耐热稳定性和高品质的肉类蛋白，利用双向电泳分析原料肉的蛋白质表达谱图，结果表明，双向电泳可以识别调节蛋白、代谢酶、某些肌原纤维蛋白和血浆蛋白的特定蛋白质，并以此观察不同原料肉的蛋白质结构，将其中的不同点作为肉类产品的标志。

　　离子交换层析法

　　离子交换层析是根据电荷差异来分离带电离子不同的蛋白质、多肽、氨基酸等带电分子的技术。 当溶液的